修复创伤、组织再生甚至器官再生，一直是生物领域科学家努力攻克的难题。尽管人类具有一定的再生能力，例如皮肤、指甲、子宫内膜和肝脏可以自然再生，但是这种能力与火蜥蜴、斑马鱼、非洲爪蟾等脊椎动物的再生能力相比就相形见绌了。为了促进再生医学的发展，科研工作者在组织再生有关的生物学过程方面已经进行了许多努力。其中，斑马鱼和青鳉鱼是被广泛使用的脊椎动物模型，因为它们可以再生许多器官，例如中枢神经系统、心脏、肾脏，尤其是它们的尾鳍可以在截肢后具有无限的再生潜力。并且它们在幼鱼阶段具有透明的身体。为了研究组织再生过程中的生物学过程，生物学家最流行的研究方法是使用带有荧光蛋白标记的转基因荧光鱼。尽管荧光蛋白融合的转基因技术为研究活细胞中的蛋白质提供了可能性。然而，该技术复杂、费时、昂贵、易于光漂白。而且荧光蛋白的大分子尺寸可能会影响目标融合蛋白的功能。另一种流行的研究方法是荧光免疫组织化学染色。但是它需要固定和透化细胞，可能导致一些缺陷，例如，蛋白质被提取或移位、蛋白质表位受阻以及不能进行实时成像，因此可能导致一些生物过程的信息是错误的或者缺失的。因此，迫切需要一种简单的研究方法，能够实时观察组织再生过程中的生物变化。

最近，香港科技大学唐本忠院士课题组与王文雄教授课题组合作，设计了一款比率计量型AIEgen探针，首次实现了在青鳉幼鱼活体内实时监测其尾鳍再生过程中溶酶体pH的分布和pH值的变化。众所周知，溶酶体pH是指示溶酶体水解酶活性和溶酶体功能状况的重要参数，并且能提示细胞自噬的作用。因此，实时追踪溶酶体的pH变化可以更全面地了解组织再生过程中的生物变化。

AIEgen的性质

适合用于组织再生期间追踪溶酶体pH的探针需要满足以下要求：（1）好的光稳定性；（2）长期跟踪能力；（3）靶向溶酶体；（4）对pH敏感；（5）定量测量pH；（6）小鱼体内无创成像。然而，传统的ACQ探针由于强烈的π-π堆积而在高浓度或聚集状态下存在荧光猝灭的问题，并且容易被光漂白，不适用于长期跟踪。与ACQ材料相比，AIE材料越多，其亮度就越亮。近几十年来的研究已证明AIEgens具有优异的光稳定性，大的斯托克斯位移，出色的长期跟踪能力和良好的生物相容性。

图1示出了AIEgen （CSMPP）的晶体结构和其聚集诱导发光的性质。

pH响应性和光稳定性

CSMPP质子化后分子内电荷转移的增强引起发射光谱极大的红移，基于此而实现了比率型pH探针。此探针克服了基于强度变化的荧光探针受探针浓度变化和分布不均，温度，环境极性和激发光波动的影响的问题。CSMPP还具有pH响应的可逆性，而且能特异性测试pH而不受生命系统中某些常见化学物质的干扰，以及具有良好的光稳定性。另外，CSMPP的绝对pKa为4.75±0.02，刚好处于溶酶体的酸度窗口（pH 4.5-5.5），说明探针能够测量溶酶体的pH。

图2示出了CSMPP的pH响应性，可逆性以及抗干扰性。

图3示出了CSMPP，LTR和LTG分别染色的HeLa细胞在使用CLSM连续扫描后的光稳定性。

青鳉幼鱼成像以及尾鳍内溶酶体的靶向

荧光共定位成像的结果表明，CSMPP对幼鱼尾鳍的溶酶体具有与LysoTracker DeepRed（LTDR）一样好的靶向性。

图4示出了青鳉幼鱼的全身成像和尾鳍的溶酶体共定位成像。

鱼细胞内pH的定量标准曲线

借助于H+/K+反向转运尼日利亚菌素和H+/K+反向转运莫能菌素来使细胞内外的pH均质化，获得了不同pH下鱼细胞的荧光比率图像和pH校准曲线。结果显示在pH 3.0-6.5之间呈线性关系，这种线性关系将用于计算尾鳍的溶酶体pH值。

图5示出了小鱼细胞在不同pH下的比率型荧光图片以及探针的pH定量标准曲线。

长期追踪青鳉幼鱼的尾鳍再生过程

CSMPP追踪了尾鳍从截断到再生逐渐恢复变成圆形的过程。并且显示了在截断后平均溶酶体pH先逐渐降低，在截断后24-48 h达到最低pH。这是胚细胞形成的阶段。由于此阶段的再生主要依靠自噬来清除损伤造成的受损组织和细胞碎片。因此，为了帮助自噬降解，细胞的溶酶体酸化被上调。而且在此阶段，截断平面周围的溶酶体（包括再生组织）比远离截断平面的溶酶体的酸性更强。然后，随着尾鳍的再生恢复，溶酶体的pH在120 h后也恢复至接近正常水平。

图6示出了截断前和截断后不同时间的青鳉幼鱼尾鳍的激光共聚焦图片和溶酶体pH分布的比率型图片。

图7示出了青鳉幼鱼尾鳍再生过程中其溶酶体的平均pH变化。

因此，该研究提供了一种简单而定量的动态跟踪方法来研究组织再生过程。并且该AIEgen探针还可用于追踪各种溶酶体相关的生物过程，例如压力反应，炎症反应等。另外，该研究有助于启发设计其它比率型荧光探针用于长期可视化跟踪生物学的过程。以上相关成果发表在《Chemical Science》 (Chem. Sci., 2020,DOI: 10.1039/C9SC06226B.)上。论文的第一作者为香港科技大学博士后石秀娟，共同一作为香港科技大学博士生颜能，通讯作者为香港科技大学唐本忠院士，共同通讯作者为香港科技大学王文雄教授和郭子健研究助理教授。

参考文献：X. Shi, N. YAN, G. Niu, S. H. P. Sung, Z.Liu, J. Liu, R. T. K. Kwok, J. W. Y. Lam, W. Wang, H. H-Y. Sung, I. D. Williamsand B. Z. Tang, Chem. Sci., 2020, DOI: 10.1039/C9SC06226B.

原文链接：https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2020/sc/c9sc06226b#!divAbstract