【背景摘要】

细胞与细胞外基质（ECM）之间的作用力和相对运动对于组织在发育过程中的自组织至关重要。但是，在工程方法中可以控制这些动力学的空间范围是有限的，这阻碍了构造大型，结构成熟的组织的进展。在此，宾夕法尼亚大学Alex J. Hughes教授团队在6月国际材料顶级期刊《Advance Materials》描述了可合理控制多细胞网络的形状和大小的称为“kinomorphs”的形变水凝胶材料。Kinomorphs是ECM薄片，可根据其中的细胞收缩模式改变其形状，大小和密度。该研究题为“Guiding Cell Network Assembly using Shape-Morphing Hydrogels”。

研究表明，这些变化可以同时操纵许多空间位置上皮细胞的结构形成行为。Kinomorphs是使用新的光刻技术构建的，可将单个细胞图案化并比先前描述的大10倍。这些模式旨在部分模拟胚胎肾脏上皮网络的分支几何形状。然后，模拟来预测kinomorph形状的变化。最后，形态动力学提供了一个厘米级的程序，该程序设置了特定的空间位置，通过细胞合并和结构成熟，形成了直径约50 µm的上皮小管。通过在新兴的类系统（如类器官）中扩展细胞自组织的空间范围，该类晶体可以显着促进器官尺度组织的构建。

【图文解析】

MDCK细胞是一种功能完善的模型系统，它是肾小管衍生的细胞系家族。在某些3D培养条件下，MDCK形成球状或随机定向的小管，通过定义不同的顶端（面向内腔）和基底侧而变腔（形成内部腔）。实现此目的的一种方法是设置支架的起始组成和几何形状，在其中利用ECM的细胞重塑来创建空间应变模式（图1A）。这些应变模式将增加编程位置中的细胞密度，导致细胞融合（凝聚），同时还实现了局部ECM光纤募集，这被认为可以促进多尺度细胞网络的组装。接着将载有光反应性二苯甲酮-甲基丙烯酰胺共聚单体的30 µm厚的4％聚丙烯酰胺水凝胶片聚合到载玻片上（图1B）。通过光掩模施加254 nm的光，然后将未修饰的ssDNA寡核苷酸拴在凝胶上和凝胶内，特征尺寸低至10 µm（图1C）。可以通过空间配准在同一张幻灯片上执行多链的连续模式化，以指导不同细胞群体的粘附。图案化的DNA量和在pDPAC底物上的细胞捕获效率都随图案化的DNA中的紫外线剂量或胸腺嘧啶碱基的比例而增加（图1D）。

图1. 形状可变的ECM材料包含用于在空间上控制上皮网络形成的光刻细胞图案。

随着大规模细胞图案化方法的到位，作者试图编码将促进MDCK肾小管生成的折痕网络。简而言之，需要（1）将pDPAC细胞图案嵌入ECM板的设备，（2）上皮网络的参考几何结构作为设计目标，（3）模型来预测如何模拟参考几何结构的折痕网络会从ECM工作表中出现。对于该设备：作者创建了一个大型流通池设备，该设备将两个 “2×3” pDPAC基板夹在相隔≈250µm的距离内（图 2A）。流动槽可在聚丙烯酰胺的顶部和底部表面均具有细胞图案，在将凝胶前体混合物置于其中后，细胞将从细胞图案转移到胶原蛋白I-Matrigel ECM片中。然后将ECM片材（称为kinomorph）进行解剖和培养以进行实时成像。对于该模型：作者创建了一个自定义折纸模拟器，以使折痕网络的空间变换能够进行实时原型制作（图2B）。通过测量“Hausdorff距离”验证模拟器与它创建从体外折叠kinomorphs的共聚焦显微镜图像生成的那些网格3D之间。“最高闪光器”设计具有从单个边缘发出的山地和山谷网络。这些网络分叉的概率与在胚胎小鼠输尿管上皮的分支层次结构的较宽范围内观察到的概率大致相似（图2C）。闪光器的最高折痕也通过旋转动力学一起塌陷，随着折痕静止角度的增加，旋转动力学沿任何给定的径向方向产生相似的“整体应变”（图2D）。选择了折痕系列后，开始将闪光折痕网络转换为单元模式。首先创建了“折痕块”，即在各向异性网格图案中设置了20 µm直径的ssDNA特征集。每个特征都代表一个掩膜位置，在该位置上DNA沉积在pDPAC基板上，因此细胞被图案化（图2E）。

图2.大型模型指导的kinomorphs设计和生产。

由于细胞簇在亲核形态折叠过程中融合，因此作者接下来想知道这对沿亲核形态压实区域的细胞和ECM密度有何影响（图 4A）。回到整个kinomorph规模，细胞网络跨越了直至≈3cm的折痕网络的路径（图4B）。此外，在类似的“折叠度”下的折纸模拟在很大程度上反映了奇诺形折痕之间的相对空间关系。例如，肾小管的方向分布显示了kinomorph和模拟之间的高度对应关系，而由“无向”自由浮动ECM片材中的MDCK球状体阵列形成的肾小管没有显示任何方向偏好（图4C）。作者试图测试折痕微环境是否适合MDCK小管的结构成熟。约50％的MDCK 折痕长度的柱状MDCK小管带有适当定位的F-肌动蛋白（顶端）和E-钙黏着蛋白（横向）极性标记，以及沿基底ECM界面分布的3T3（图4D）。值得注意的是，这些小管沿着指定几何形状的工程奇诺形变折痕形成，形成的空间比例要比目前3D打印可获得的小5至20倍。最后，胶原蛋白I纤维沿这些小管的基底表面排列，并与细胞内的肌动蛋白应激纤维共取向，这可能意味着紧密区域的ECM提示与那里的上皮自组织之间存在紧密的联系（图4E）。

图4. Kinomorphs在紧密的折痕处指导上皮的自我组织和结构成熟。

【总结陈述】

总而言之，科研工作者们相信kinomorphs将作为动态组织工程工作的可定制框架。Kinomorphs提供了一种有用的工程策略，可以控制从单个细胞到接近整个器官的上皮组织的长度尺度。

【通讯简介】

Alex Hughes，现任宾夕法尼亚大学（宾大）工程与应用科学学院生物工程助理教授，宾大佩雷尔曼医学院细胞与发育生物学第二把手，宾大生物工程研究小组成员，细胞与分子生物学研究组成员（发育，干细胞和再生生物学计划）。博士后在加州大学旧金山分校任Jane Coffin Childs研究员（导师：Zev Gartner教授），研究生在加州大学伯克利分校（导师：Amy Herr教授），本科在新西兰奥克兰大学。Alex对学习控制在成年组织建立胚胎中发生的图案化过程特别感兴趣，通过开发新的细胞成像，组织构造，软材料和微型工程技术来解决这一问题。Alex发表超过12篇论文，包括多篇Nature子刊及知名专业期刊。